背景及研究目的

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是自身免疫介导的弥漫性结缔组织病，可累及全身多器官，包括肾脏、肺脏、血液系统和神经系统等。糖皮质激素（glucocorticoid，GC）是SLE治疗的基石用药，通过抑制过度活化的T、B细胞而发挥免疫抑制作用，但糖皮质激素对Treg的作用一直存在争议。因此，深入研究SLE患者GC治疗后Treg的改变及其分子机制，是改善GC临床治疗的重要研究方向。

方式

通过流式细胞计数法检测北京大学人民医院的25例SLE患者（14例应用GC联合低剂量IL-2治疗，11例接受GC治疗不联合应用低剂量IL-2）外周血Treg、Treg亚群的水平并比较。体外应用流式细胞计数法检测健康对照和SLE患者外周血CD4+T细胞不同剂量IL-2和GC处理后Treg、Treg亚群及其重要标记物的水平并比较。应用T-test等评估GC和GC联合IL-2短期治疗后SLEDAI、补体等SLE病情改善情况。

主要结果

在未使用小剂量IL-2的情况下加用泼尼松治疗，外周血Treg细胞比例下降的患者占36.36%(4/11)，而加用泼尼松联合100万IU隔日皮下注射rhIL-2治疗的患者未见Treg细胞比例下降(0/14)。在补充小剂量IL-2的情况下，92.86%的患者Treg水平明显升高。相比之下，在不应用IL-2的情况下使用泼尼松治疗时，只有27.27%的患者出现Treg比例升高(图1a)。我们还观察到，在泼尼松联合小剂量IL-2治疗后，Treg细胞的绝对数量显著增加，而单独使用泼尼松治疗导致Treg绝对数量显著减少(补充图1)。我们进一步描述了由CD25和CD45RA表达定义的Treg亚群的变化5(图1b)。泼尼松联合小剂量IL-2治疗后，SLE患者外周血总Treg(CD4+CD25hiCD127low)、活性Treg(CD4+CD127lowCD45RA-CD25+++)及静息Treg (CD4+CD127lowCD45RA+CD25+++)比例均显著升高，而泼尼松组差异无统计学意义(Fig. 1a, p=0.033 vs p=0.811; Fig. 1c, p=0.042 vs p=0.463; Fig. 1d, p=0.006 vs p=0.688)。在泼尼松组的大多数病例中，总Treg、活性Treg和静息Treg均降低(图1b、c、d)。在所有IL-2联合治疗组患者中，Treg细胞CD25 (IL-2受体α)表达也显著增强。相比之下，在接受泼尼松单独治疗的患者中，36.36%(4/11)的Treg的CD25水平降低(图1e)。CD25的表达水平与IL-2信号通路和Treg 1的激活相关，这一结果提示泼尼松治疗可能会降低一部分患者的Treg活性，而在泼尼松治疗的患者中补充小剂量IL-2可有效恢复体内Treg活性(图1e)。对泼尼松治疗后Treg细胞减少的患者，在泼尼松治疗不变的基础上加用小剂量IL-2。结果显示，小剂量IL-2补充逆转了糖皮质激素诱导的Treg减少，进一步证实了小剂量IL-2减轻了糖皮质激素诱导的Treg损伤(图1f)。

体内泼尼松的生物活性产物泼尼松龙单独在体外处理Treg细胞，显著损害了Treg分化和功能的多个关键分子。在泼尼松龙治疗中补充低剂量IL-2对这些分子有保护作用。泼尼松龙治疗下调CD4+T细胞中Foxp3的表达，IL-2显著逆转泼尼松龙诱导的SLE患者和健康供者CD4+T细胞中Foxp3表达的降低(图1g, p<0.05)。CD4+Foxp3+ Treg细胞表达CD39、CTLA-4和ICOS，这些是参与其免疫抑制功能的效应分子2,3。Bcl-2的表达对维持Treg的存活至关重要。我们发现泼尼松龙显著降低CD4+Foxp3+ Treg细胞中CD39的表达，而IL-2显著逆转泼尼松龙的作用(补充图2a, p<0.05)。同样，在健康供者和SLE患者中，补充IL-2逆转了泼尼松龙对Treg细胞中ICOS表达的下调作用(补充图2b)。然而，SLE患者Treg中ICOS的上调未达到统计学显著差异，这与SLE患者treg对IL-2的敏感性低于健康人的报道一致4(补充图2b)。在SLE患者和健康对照中，IL-2也可上调Treg细胞中Bcl-2的表达(补充图2c, p<0.05)。与CD39和ICOS不同，CTLA-4的表达不受泼尼松龙或IL-2的影响(补充图2d)。

Foxp3和这些效应分子的表达是由STAT5的激活驱动的。我们的研究表明，泼尼松龙治疗诱导SLE患者和健康供者的treg中STAT5磷酸化降低，而泼尼松龙+ IL-2显著增加pSTAT5水平(图1h)。

上述结果提示在泼尼松治疗的基础上加用小剂量IL-2对Treg细胞有益，可能有助于抑制自身免疫。为了确定在泼尼松治疗的基础上补充小剂量IL-2是否有任何临床获益，我们比较了泼尼松单独治疗和泼尼松联合小剂量IL-2治疗SLE患者的临床指标变化。治疗2周后，我们发现泼尼松联合小剂量IL-2组的SLEDAI下降更明显(图1i)。泼尼松联合小剂量IL-2治疗组85.71%的患者SLEDAI下降，而63.64%的仅使用泼尼松治疗的患者SLEDAI下降(图1j)。IL-2联合治疗组C3和C4升高更明显(图1k和图1l)。在泼尼松+ IL-2组中，C3或C4升高的患者百分比较高(图1j)。

结论

综上所述，我们的研究表明，小剂量的IL-2可以减轻糖皮质激素诱导的Treg细胞损伤，从而可能促进SLE更快改善。

评论

糖皮质激素降低Treg细胞的机制可能与下调CD25、Foxp3和pSTAT5水平有关。Foxp3和STAT5都是Treg发育、分化和表型维持中不可或缺的转录因子。减少Foxp3的表达和STAT5激活强的松治疗可能损害Treg分化和表型维持。IL-2-IL-2受体相互作用也是维持Treg正常功能所必需的，通过诱导下游STAT5活化和Foxp3表达，进而进一步促进IL-2受体亚基CD25的转录和增强IL-2信号传导。因此，泼尼松诱导的Treg细胞CD25表达降低也可能破坏Treg细胞IL-2信号的正反馈回路，导致Treg细胞减少。